本发明公开了一种基于免疫磁珠法的胞外囊泡表面蛋白特异适配体筛选技术,包括以下步骤：1)合成上、下游引物及随机文库；2)培养目标细胞及获取细胞培养上清；3)粒径选择法提取胞外囊泡；4)表面修饰CD63抗体的免疫磁珠捕获胞外囊泡；5)正筛获取可与靶标胞外囊泡结合的文库序列；6)正负交替筛选获得特异性目标核酸适配体；7)流式细胞仪技术检测文库的富集情况。本发明采用粒径选择法提取胞外囊泡,简单快速且胞外囊泡回收率高,使用表面修饰CD63抗体的免疫磁珠捕获外泌体,可快速分离胞外囊泡,进一步通过正筛及正负交替筛,可提高目标核酸适配体的筛选效率,利用筛选的适配体,可以开展以胞外囊泡表面蛋白为靶标的疾病液体活检及治疗。
This invention discloses a technology for screening specific aptamers for surface proteins of extracellular vesicles based on the immunomagnetic bead method, comprising the following steps: 1) synthesis of upstream and downstream primers and a random library; 2) culturing target cells and obtaining cell culture supernatant; 3) extracting extracellular vesicles using size selection method; 4) capturing extracellular vesicles with immunomagnetic beads modified with CD63 antibodies; 5) positive screening to obtain library sequences that can bind to target extracellular vesicles; 6) alternating positive and negative screening to obtain specific target nucleic acid aptamers; 7) using flow cytometry to detect the enrichment of the library.This invention utilizes the size selection method to extract extracellular vesicles, which is simple, fast, and yields a high recovery rate of extracellular vesicles. By using immunomagnetic beads modified with CD63 antibodies to capture exosomes, extracellular vesicles can be rapidly separated. Furthermore, positive screening and alternating positive and negative screening can improve the efficiency of screening target nucleic acid aptamers. With the screened aptamers, liquid biopsy and therapy targeting surface proteins of extracellular vesicles related to diseases can be conducted.
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基于免疫磁珠法的胞外囊泡表面蛋白特异适配体筛选技术,其特征在于,包括以下步骤:
1)合成上、下游引物及随机文库;
2)获取目标细胞培养上清;
3)粒径选择法提取胞外囊泡;
4)表面修饰CD63抗体的免疫磁珠捕获胞外囊泡;
5)正筛获取与胞外囊泡结合的文库序列:
6)正负交替筛选获得特异性目标核酸适配体:
7)流式细胞仪监测文库富集情况。 -
根据权利要求1所述的基于免疫磁珠法的胞外囊泡表面蛋白特异适配体筛选技术其特征在于:步骤1)中随机文库为80 nt的单链寡核苷酸,所述单链寡核苷酸的序列为5’GTTGGTGAGGTAACGGCTCA-40nt-TAGGTGGCAAGCGTTATCCG-3,其中,40 nt表示40个核苷酸碱基(nt)的随机序列,所述上、下游引物序列分别为:上游引物F(SEQ ID NO:1):5’-FAM-GTTGGTGAGGTAACGGCTCA-3’;下游引物R(SEQ ID NO:2):5’-biotin-CGGATAACGCTTGCCACCTA-3’;其中FAM为荧光标记,Biotin为生物素标记。
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根据权利要求1所述的基于免疫磁珠法的胞外囊泡表面蛋白特异适配体筛选技术其特征在于:步骤2)中获取目标细胞培养上清为:将目标细胞置于胎牛血清(FBS)中培养，待细胞生长至稳定状态时,置于无胞外囊泡的胎牛血清(FBS)继续培养,待细胞生长至铺占皿底的70%~80%时,获取细胞培养上清。
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根据权利要求3所述的基于免疫磁珠法的胞外囊泡表面蛋白特异适配体筛选技术，其特征在于:步骤3)中粒径选择法提取胞外囊泡为:将步骤2)中收集的细胞培养上清通过真空抽滤泵根据需要分别过20nm-5000nm孔径大小的滤膜过滤,清洗液清洗三遍后,用PBS缓冲液重悬收集胞外囊泡,Nanosight粒度仪测定提取的胞外囊泡浓度。
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根据权利要求4所述的基于免疫磁珠法的胞外囊泡表面蛋白特异适配体筛选技术,其特征在于:步骤4)中表面修饰CD63抗体的免疫磁珠捕获胞外囊泡为:将表面修饰有CD63抗体的免疫磁珠用分离液清洗一遍,并溶于分离液中,适量加入步骤3)中提取的胞外囊泡然后置于4℃下孵育过夜,使用磁铁磁分离后,用分离液清洗三遍,除去未结合的胞外囊泡，保留捕获胞外囊泡的免疫磁珠。
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根据权利要求5所述的基于免疫磁珠法的胞外囊泡表面蛋白特异适配体筛选技术，其特征在于:步骤5)中的正筛包括如下步骤:
5.1)随机文库与捕获胞外囊泡的免疫磁珠孵育:将随机文库溶于结合液中,金属浴95℃高温处理5min后立即冰浴10min,形成单链二级结构,然后与步骤4)中捕获胞外囊泡的免疫磁珠混合,4℃孵育90min;
5.2)胞外囊泡与游离DNA的分离:使用磁铁将步骤5.1)孵育后混合液中的免疫磁珠磁分离后,去上清,清洗液清洗后,用TE缓冲液重悬结合有胞外囊泡的免疫磁珠,100℃煮沸后,磁分离此免疫磁珠,然后收集含有单链二级结构的上清液;
5.3)次级文库的制备
5.31)PCR扩增:以步骤5.2)中收集的含有单链二级结构的上清液为模板,以步骤1)中合成的上、下游引物为特异性引物对,进行PCR扩增,获得PCR扩增产物,PCR扩增的条件为:
扩增体系:上、下游引物F/R(10mMD)各0.5m,模板20ng,2xpremix 10mL,补充ddHz0至总体积为20mL:
扩增程序:95℃ 5 min,95℃ 30s,58.6℃ 30s,72℃ 30s,共N轮循环,72℃ 3 min;4℃保存;
其中,循环轮数N轮根据前轮筛选中凝胶成像结果优化确定,首轮扩增8个循环;
5.32)磁分离PCR扩增产物:将步骤5.31)中的修饰有生物素的PCR扩增产物与链霉亲和素免疫磁珠孵育结合,磁分离链霉亲和素免疫磁珠,去上清,使用分离液清洗后加入氢氧化钠,制备得到单链SSDNA作为次级文库,用超微量紫外分光光度计测量次级文库的浓度。 -
根据权利要求6所述的基于免疫磁珠法的胞外囊泡表面蛋白特异适配体筛选技术，其特征在于:步骤5)中的正筛连续进行5-6轮,在这5-6轮正筛中,下一轮正筛中与步骤4)中免疫磁珠捕获的胞外囊泡结合的单链为上一轮正筛中制备的次级文库经金属浴95℃高温处理5min后立即冰浴10min所得产物。
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根据权利要求7所述的基于免疫磁珠法的胞外囊泡表面蛋白特异适配体筛选技术其特征在于:步骤6)中的负筛包括如下步骤:
6.1)提取正常细胞胞外囊泡:通过粒径选择法过滤获得正常细胞胞外囊泡,通过Nanosight粒度仪分析提取的正常细胞胞外囊泡的浓度;
6.2)分离未与正常细胞胞外囊泡结合的核酸适配体:将按照步骤5.3)中方法制备的次级文库与免疫磁珠捕获的正常细胞胞外囊泡混合孵育,然后通过磁分离的方法,收集上清液。 -
根据权利要求8所述的基于免疫磁珠法的胞外囊泡表面蛋白特异适配体筛选技术其特征在于:步骤6)中正负交替筛选为进行一次正筛和一次负筛算一轮筛选,在一轮负筛后,紧接着进行下一轮正筛,在下一轮正筛中,与步骤4)中免疫磁珠捕获的胞外囊泡结合的单链为上一轮负筛中收集的上清液,单链经金属浴95℃高温处理5min后立即冰浴10min处理。
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根据权利要求9所述的基于免疫磁珠法的胞外囊泡表面蛋白特异适配体筛选技术其特征在于:步骤5)中正筛与步骤6)中正负交替筛选的总筛选轮数为10-20轮,在步骤5)的正筛连续进行5-6轮后,引入负筛进行正负交替筛选,在正负交替筛选中,正筛孵育的时间逐渐缩短,分离时通过逐渐增加清洗次数以逐渐增大清洗力度,负筛时间逐渐增长,逐渐增加筛选压力,以获得特异性核酸适配体。
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根据权利要求10所述的基于免疫磁珠法的胞外囊泡表面蛋白特异适配体筛选技术,其特征在于:步骤7)中采用流式细胞仪检测技术检测与次级文库混合孵育后的胞外囊泡的荧光强度,当筛选达到一定轮数时,检测到的荧光强度值不再发生变化,趋于稳定,表明次级文库得到成功富集,筛选达到平台期,可终止筛选。
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